METODOLOGÍA PARA SEPARACIÓN DE PIGMENTOS FOTOSINTÉTICOS

La fotosíntesis funciona en primer lugar gracias a la existencia de pigmentos específicos, que tienen la capacidad de absorber la energía de los fotones. Los pigmentos de mayor importancia son las clorofilas: la clorofila A que tiene un color verde azulado, y la clorofila B de color verde amarillento. También son importantes los carotenoides, de color anaranjado-rojizo, y las xantofilas de color amarillo. Las algas y bacterias fotosintéticas contienen además otros pigmentos que les permiten ampliar el espectro de longitudes de onda cuya energía pueden absorber.

Para la separación de los diferentes pigmentos fotosintéticos, se pueden emplear diferentes técnicas cromatográficas, ya sea en columna, de gases, en fase liquida etc, las más sencillas son la de placa fina y la cromatografía en papel, que es la que vamos a usar. 

En todos los tipos de cromatografía hay una fase móvil que consiste en un fluido (gas, líquido o fluido supercrítico) que arrastra a la muestra a través de una fase estacionaria que se trata generalmente de un sólido o también de un líquido fijado en un sólido. Los componentes de la mezcla a separar, interaccionan en distinta forma con la fase  móvil y la estacionaria, ya sea por diferencias en carga eléctrica, densidad o solubilidad. De este modo, los componentes atraviesan la fase estacionaria a distintas velocidades y se van separando. Diferencias sutiles en la afinidad de los componentes de la mezcla con las fases móvil y estacionaria del sistema, da como resultado una retención diferencial sobre la fase estacionaria y por tanto una separación efectiva en función de los tiempos de retención de cada componente de la mezcla.

En la cromatografía en placa fina, la fase estacionaria es una placa de vidrio o metal con una capa de sílice (sobre la que corre la fase móvil), en la de papel es el papel filtro (papel de celulosa de alta pureza), y la fase móvil es algún solvente en el que los componentes de la mezcla sean solubles, pero con diferencias en el grado de solubilidad con este, para ello pueden usarse mezclas de solventes y es importante buscar la que permita una mejor separación de los componentes.

Al entrar en contacto con los disolventes empieza su fase de movilidad, lo que produce unas manchas características sobre el papel, generalmente cuando estas no son coloreadas se revelan con una lámpara fluorescente, los contornos de las manchas se marcan con lápiz, para después medir y calcular el Rf.  Como medida de referencia, para identificar las sustancias separadas del compuesto problema en la cromatografía sobre papel, se emplea el Rf (Retention factor)  el cual se define como el cociente obtenido al dividir la distancia recorrida por la sustancia, entre la recorrida por el disolvente, esto es, la distancia medida desde el origen hasta el límite de la mancha (X) dividida entre la distancia medida desde el origen hasta el frente del disolvente (S). 𝑅𝑓 = 𝑋/S

En esta práctica, se pretende separar los pigmentos fotosintéticos, para ello se emplearán dos solventes, acetona (propanona) para extraer los pigmentos de las hojas y éter de petróleo como fase móvil de la cromatografía.

La metodología es como sigue:

Para la extracción

• Se seleccionan las hojas de las que se extraerán los pigmentos, no deben estar maltratadas ni con manchas que indiquen alguna parasitosis o enfermedad. Se les retira la nervadura central (que se desecha) y  se cortan en secciones pequeñas, se pesan 10 gramos y se ponen en el mortero con 5 ml de acetona, se trituran con el pistilo del mortero hasta que el líquido se vea de un color intenso, si es necesario se puede agregar 5 ml más de acetona.

• Se eliminan los restos de las hojas tratando de presionarlas para exprimir el líquido.

• El líquido se deja evaporar a que queden 2 ml (lo que cabe en el microtubo que se les dará).

• Se vacía el extracto al microtubo Eppendorf con ayuda de un gotero o pipeta Pasteur.

Para la cromatografía

• Cada equipo tendrá el extracto de una planta, pero todos los equipos correrán el cromatograma de todos los extractos, es decir cada equipo correrá 6 cromatogramas.

• Cada equipo tendrá 6 papeles ya cortados y marcados, en la parte posterior y con lápiz pondrán el nombre del extracto correspondiente y el número de su equipo.

• Toman un capilar y lo sumerjen en el microtubo con el extracto correspondiente, lo retiran tapando el extremo superior con el dedo.

• Con cuidado colocarán la punta del capilar sobre el punto marcado en el papel, retiran el dedo y retiran el capilar, de manera que solo quede una mancha pequeña sobre el papel.

• Se agita levemente el papel hasta que la mancha se seque.

• Se repite10 veces el procedimiento sobre el mismo punto y secando entre cada aplicación, ya que el objetivo es lograr que se concentre el extracto en un mismo punto, pero tratando que la mancha sea lo más pequeña posible, evitando que se difunda y se extienda el extracto. Conforme el extracto se concentre lo más posible en la menor superficie, se obtendrá un cromatograma más nítido.

• En el vaso de precipitados de ____ ml verter 20 ml de éter de petroleo. Poner el vaso sobre una superficie plana e introducir el papel con el extracto de manera que el punto donde se colocó el extracto quede hacia abajo y el papel lo más recto posible sin que se doble. Esta operación debe hacerse en un solo movimiento, una vez que el papel ha tocado el éter de petróleo no debe moverse.

• Tapar el vaso con un vidrio de reloj para que el vapor del solvente sature el interior del vaso y se deja correr el cromatograma hasta que el solvente toque la línea marcada en la parte superior del papel.

• EN TODO EL PROCEDIMIENTO DEBE EVITARSE MOVER EL VASO CON EL CROMATOGRAMA PUES SE INTERRUMPE LA DIFUSIÓN DEL SOLVENTE Y EL CROMATOGRAMA SE DISTORSIONA.

• Sacar el cromatogama del vaso y dejar secar, cuando se haya secado marcar con lápiz delimitando las áreas de cada color (verde azulado, verde amarillento, amarillo y naranja).

• Medir desde el punto de origen la distancia recorrida por el solvente y por cada uno de los pigmentos.

• Calcular el Rf de cada pigmento en todos los cromatogramas.

• En una tabla colectar los datos de Rf obtenidos por todos los equipos.

Comparar todos los cromatogramas con los de de la zanahoria y de la espinaca que se usarán como referencia.

Ahora vean la información contenida en el siguiente enlace:    https://www.uam.es/docencia/jppid/documentos/practicas/actuales/guion-p6.pdf

En este caso lo primero que hay que entender es que el Rf (factor de retención) y este valor no es más que la posición en que queda el pigmento con respecto a lo que recorrió el solvente. es decir. es el lugar donde queda la mancha de cada pigmento en particular dentro del cromatograma. Este valor es el que nos permite identificar a la sustancia (en este caso el pigmento) en cuestión.
En otras palabras cada pigmento cuando se corre exactamente bajo el mismo sistema (tipos de solventes, tipo de papel, temperatura, cantidades de solventes, grado de concentración de las muestras, etc.), debe tener siempre el mismo Rf, sea que provenga de la espinaca (control) o de cualquiera de las otras hojas que emplearon, por lo que no debería haber dispersión en los datos.
Por esta razón y para validar los datos que obtuvieron, van como primer paso, a calcular la media y la D.E. de cada pigmento, incluyendo los de todos los tipos de hoja, lo importante aquí será que aunque si hay variación, ustedes puedan inferir que con cierta confianza, pueden en efecto identificar cada pigmento en las hojas y saber cuales están presentes en cada una. En la conclusión, también contemplen que no es el único criterio por que otro criterio en el caso de los pigmentos es el color.

Les pongo un ejemplo de como podría ser la Tabla:

		Pigmentos Rf
Tipo de hoja	Repeticiones	clorofila	clorofila	xantofila	caroteno
Espinaca	Eq. 1
	Eq. 2
	Eq. 3
	Eq. 4
	Eq. 5
hoja roja	Eq. 1
	Eq. 2
	Eq. 3
	Eq. 4
	Eq. 5
hoja amarilla	Eq. 1
	Eq. 2
	Eq. 3
	Eq. 4
	Eq. 5
	Media
	Desv. Est.

La gráfica quedaría semejante a la siguiente:

Después discuten esta gráfica considerando las Desviaciones estándar como indicadoras de errores, pero evidenciando el patrón que les permite reconocer las diferencias entre cada pigmento. 

Ahora, para responder a su pregunta de investigación, la cual depende de lo que trabajó cada salón,  deberían haber puesto en su marco teórico cuales son los pigmentos que intervienen en la fotosíntesis directamente, cuales son accesorios y como intervienen, su espectro de absorción y explicar porque podría o no haber diferencias en el número de pigmentos que hay en unas plantas y otras, independientemente de las diferencias en su  color y en base a esa información haber planteado una hipótesis.

Para responder a esto,  deberán hacer otra tabla, donde por cada tipo de hoja o tejido ponen el número de pigmentos que encontraron (0, 1, 2, 3 o 4) es decir una tabla como la que sigue en cada equipo 

	Espinaca	Zanahoria	planta 1	planta 2	planta 3	planta 4
Clorofila Beta	1	0	1	1	0	1
Clorofila Alfa	1	0	1	1	1	1
Xantofilas	1	0	0	1	0	0
B Cartoteno	1	1	0	1	0	1
Total	4	1	2	4	1	3

Dado que cada equipo es una repetición, construyen otra tabla con los datos de todos, calculan media y desviación estándar 

	equipo 1	equipo 2	equipo 3	equipo 4	equipo 5	equipo 6	Media	Desv. Est.
Espinaca	4
Zanahoria	1
planta 1	2
planta 2	4
planta 3	1
planta 4	3

y presentan los resultados también en una gráfica de columnas con las barras de error de la desviación estándar. en base a esta tabla primero interpretan, luego discuten y concluyen respondiendo a su pregunta y dando la explicación biológica y continúan con análisis de fuentes de error, mejoras y sugerencia de ampliación. Finalmente la bibliografía que debe mostrar autores, año de publicación, título del artículo, dirección de Internet, fecha de consulta etc, dependiendo del tipo de fuente también otros datos como volumen, página.

El reporte debe contener todos los elementos que ya conocen.